Появление торс-ков ознаменовало новую эру в межвидовой передаче тяжелых респираторных заболеваний с глобализацией, ведущей к быстрому распространению по всему миру и массовым экономическим последствиям3,4. С тех пор в популяциях животных появилось несколько штаммов, включая штаммы гриппа А H5N1, H1N1 и H7N9, а также БВРС—КоВ, что привело к значительным заболеваниям, смертности и экономическим трудностям в пострадавших регионах5. Хотя меры общественного здравоохранения смогли остановить вспышку торс-ков4 недавние метагеномические исследования выявили последовательности близкородственных SARS-подобных вирусов, циркулирующих в популяциях китайских летучих мышей , которые могут представлять будущую угрозу1,6. Однако только данные о последовательностях дают минимальную информацию для идентификации и подготовки к будущим препандемным вирусам. Поэтому, чтобы изучить потенциал возникновения (то есть потенциал заражения людей) циркулирующих ков летучих мышей, мы построили химерный вирус, кодирующий новый зоонозный спайковый белок ков—из последовательности RsSHC014-CoV, которая была выделена из китайских подковообразных летучихмышей 1—в контексте атипичной пневмонии-адаптированный костяк мыши. Гибридный вирус позволил нам оценить способность нового спайкового белка вызывать заболевание независимо от других необходимых адаптивных мутаций в его естественном костяке. Используя этот подход, мы охарактеризовали ков-инфекцию , опосредованную спайковым белком SHC014 в первичных клетках дыхательных путей человека и in vivo, а также проверили эффективность доступных иммунотерапевтических средств против SHC014-ков. Вместе стратегия переводит данные метагеномики, чтобы помочь предсказать и подготовиться к будущим возникающим вирусам.
Последовательности SHC014 и связанного с RsWIV1-ков показывают, что эти CoVs являются ближайшими родственниками эпидемии торс-ков штаммов (фиг. 1А,B); однако существуют важные различия в 14 остатках, которые связывают человеческий ACE2 и, рецептор для SARS-коронавирус, включая пять, которые являются критическими для размещения ряд: Y442, L472, N479, T487 и Y491 (арт. 7). В WIV1 три из этих остатков отличаются от эпидемического штамма SARS-CoV Urbani, но не ожидалось, что они изменят связывание с ACE2 (дополнительный рис. 1a,b и дополнительная таблица 1Этот факт подтверждается как экспериментами по псевдотипированию, которые измеряли способность лентивирусов, кодирующих СПАЙКОВЫЕ белки WIV1, проникать в клетки, экспрессирующие человеческий ACE2 (дополнительный Рис. 1), так и анализами репликации in vitro WIV1-CoV (см. рис. 1 ). Напротив, 7 из 14 остатков ACE2-взаимодействия в SHC014 отличаются от таковых в SARS-CoV, включая все пять остатков, критичных для диапазона хозяина (дополнительный рис. 1c и дополнительная таблица 1). Эти изменения вкупе с неспособностью псевдотипированных лентивирусов, экспрессирующих Спайк SHC014, проникать в клетки (дополнительный рис. 1d), предположил, что шип SHC014 не способен связывать человеческий ACE2. Однако сообщалось, что аналогичные изменения в родственных штаммах SARS-CoV позволяют связывать ACE27,8, что свидетельствует о необходимости дополнительного функционального тестирования для верификации. Поэтому мы синтезировали Спайк SHC014 в контексте репликационно-компетентного, адаптированного к мышам остова SARS-CoV (далее мы будем называть химерный CoV SHC014-MA15), чтобы максимизировать возможности для изучения патогенеза и вакцинации у мышей (дополнительный рис. 2аНесмотря на предсказания как структурного моделирования, так и экспериментов по псевдотипированию, SHC014-MA15 был жизнеспособен и реплицировался до высоких титров в клетках Vero (дополнительный рис. 2b). Подобно SARS, SHC014-MA15 также требовал функциональной молекулы ACE2 для входа и мог использовать ортологи ACE2 человека, циветты и летучей мыши (дополнительный рис. 2c,d). Чтобы проверить способность шипа SHC014 опосредовать инфекцию дыхательных путей человека, мы исследовали чувствительность эпителиальной линии клеток дыхательных путей человека Calu-3 2B4 (ref. 9) к инфекции и обнаружена устойчивая репликация SHC014-MA15, сравнимая с таковой у SARS-CoV Urbani (рис. 1С). Чтобы расширить эти данные, первичные культуры эпителия дыхательных путей человека (HAE) были инфицированы и показали надежную репликацию обоих вирусов (рис. 1d). Вместе эти данные подтверждают способность вирусов с шипом SHC014 заражать клетки дыхательных путей человека и подчеркивают потенциальную угрозу межвидовой передачи SHC014-CoV.
Чтобы оценить роль Спайка SHC014 в опосредовании инфекции in vivo, мы заразили 10-недельных мышей BALB/c 104 бляшкообразующими единицами (p.f.u.) либо SARS-MA15, либо SHC014-MA15 (рис. 1e–h). Животные, инфицированные SARS-MA15, испытывали быструю потерю веса и летальность через 4 дня после заражения (d.p.i.); напротив, инфекция SHC014-MA15 приводила к существенной потере веса (10%), но не приводила к летальности у мышей (рис. 1е). Исследование вирусной репликации выявило почти эквивалентные вирусные титры из легких мышей, инфицированных SARS-MA15 или SHC014-MA15 (рис. 1f). В то время как легкие от ОРВИ-МА15–инфицированных мышах показали, надежное окрашивание как в терминальных бронхиол и паренхимы легких 2 д. стр. я. (Фиг. 1г), те SHC014-МА15–инфицированных мышах показали, восстанавливают проходимость дыхательных путей антигена окрашивания (фиг. 1Н); напротив, нет дефицита в антиген окрашивание наблюдалось в паренхиме или в общей гистологической оценки, предполагая, дифференциальной инфекции легочной ткани для SHC014-МА15 (дополнительная таблица 2). Затем мы проанализировали инфекцию у более восприимчивых, старых (12-месячных) животных. Зараженные SARS-MA15 животные быстро теряли вес и поддавались инфекции (Дополнительный рис. 3а,б). Инфекция SHC014-MA15 индуцировала сильную и устойчивую потерю веса, но имела минимальную летальность. Тенденции в гистологии и паттернах окрашивания антигенами, которые мы наблюдали у молодых мышей, были сохранены у более старых животных (дополнительная таблица 3). Мы исключили возможность того, что SHC014-MA15 опосредовал инфекцию через альтернативный рецептор на основе экспериментов с использованием Ace2?/? мышей,которые не показали потери веса или окрашивания антигеном после инфекции SHC014-MA15 (дополнительный рис. 4а, Б и дополнительная таблица 2Вместе эти данные указывают на то, что вирусы с шипом SHC014 способны индуцировать потерю веса у мышей в контексте вирулентного ков-вируса.
Учитывая доклиническую эффективность терапии моноклональными антителами к Эболе, такими как ZMApp10, мы затем попытались определить эффективность моноклональных антител к SARS-CoV против инфекции SHC014-MA15. Ранее сообщалось о четырех широко нейтрализующих человеческих моноклональных антителах, нацеленных на спайковый белок SARS-CoV, которые являются вероятными реагентами для иммунотерапии11,12,13 Мы исследовали влияние этих антител на репликацию вируса (выраженное в процентах ингибирования репликации вируса) и обнаружили, что в то время как дикий тип SARS-CoV Urbani был сильно нейтрализован всеми четырьмя антителами при относительно низких концентрациях антител (рис . 2а-d), нейтрализация варьировала для SHC014–MA15. Fm6, антитело, генерируемое фаговым дисплеем и escape-мутантами11,12, достигало только фоновых уровней ингибирования репликации SHC014-MA15 (рис. 2а). Аналогичным образом были получены антитела 230.15 и 227.14, которые были получены из В-клеток памяти инфицированных SARS-CoV пациентов13, также не удалось заблокировать репликацию SHC014-MA15 (рис. 2b,c). Для всех трех антител различия между спайковыми аминокислотными последовательностями SARS и SHC014 соответствовали прямым или смежным изменениям остатков, обнаруженным у escape-мутантов SARS-CoV (fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q/E), что, вероятно, объясняет отсутствие нейтрализующей активности антител против SHC014. Наконец, моноклональное антитело 109.8 смогло достичь 50% нейтрализации SHC014-MA15, но только при высоких концентрациях (10 мкг/мл) (Рис. 2dВ совокупности полученные результаты демонстрируют, что широко нейтрализующие антитела против SARS-CoV могут иметь лишь незначительную эффективность против эмерджентных SARS-подобных штаммов CoV, таких как SHC014.
Чтобы оценить эффективность существующих вакцин против инфекции SHC014-MA15, мы вакцинировали пожилых мышей двойной инактивацией цельного SARS-CoV (DIV). Предыдущая работа показала, что DIV может нейтрализовать и защитить молодых мышей от заражения гомологичным вирусом14; однако вакцина не смогла защитить пожилых животных, у которых также наблюдалась усиленная иммунная патология, что указывает на возможность нанесения вреда животным из-за вакцинации15. Здесь мы обнаружили, что DIV не обеспечивает защиту от вызова с SHC014-MA15 в отношении потери веса или вирусного титра (Дополнительный рис. 5а,б). В соответствии с предыдущим сообщением с другими гетерологичными CoVs15 группы 2b, сыворотка от DIV-вакцинированных пожилых мышей также не смогла нейтрализовать SHC014-MA15 (дополнительный рис. 5c). Примечательно, что вакцинация DIV привела к стойкой иммунной патологии (дополнительная таблица 4) и эозинофилии (дополнительная рис. 5d–f). Вместе эти результаты подтверждают, что вакцина DIV не будет защищать от инфекции SHC014 и, возможно, может усилить заболевание в пожилой вакцинированной группе.
В отличие от вакцинации мышей DIV, использование SHC014-MA15 в качестве живой аттенуированной вакцины показало потенциальную перекрестную защиту от заражения SARS-CoV, но результаты имеют важные предостережения. Мы заразили молодых мышей 104 p.f. u. SHC014-MA15 и наблюдали их в течение 28 дней. Затем мы бросили вызов мышам с SARS-MA15 на 29-й день (дополнительный рис. 6аПредшествующее заражение мышей высокой дозой SHC014-MA15 обеспечивало защиту от вызова летальной дозой SARS-MA15, хотя был только минимальный ответ на нейтрализацию SARS-CoV от антисыворотки, вызванной через 28 дней после заражения SHC014-MA15 (дополнительный рис. 6b, 1:200). В отсутствие вторичного усиления антигена 28 d.p.i. представляет собой ожидаемый пик титров антител и подразумевает, что со временем будет снижена защита от SARS-CoV16,17 Аналогичные результаты, свидетельствующие о защите от вызова летальной дозой SARS-CoV, наблюдались у пожилых мышей BALB/c в отношении потери веса и репликации вируса (дополнительный рис. 6С,г). Однако инфекционная доза SHC014-MA15 в дозе 104 p. f. u. индуцировала >10% потерю веса и летальность у некоторых пожилых животных (>Рис. 1 и дополнительный Рис. 3). Мы обнаружили, что вакцинация с более низкой дозой SHC014-MA15 (100 p.f.u.) не вызывала потери веса, но также не смогла защитить пожилых животных от смертельной дозы SARS-MA15 (дополнительный рис. 6e,fВместе взятые данные свидетельствуют о том, что SHC014-MA15 challenge может обеспечить перекрестную защиту от SARS-CoV с помощью консервативных эпитопов, но требуемая доза индуцирует патогенез и исключает использование в качестве аттенуированной вакцины.
Установив, что Спайк SHC014 обладает способностью опосредовать инфекцию клеток человека и вызывать заболевание у мышей, мы далее синтезировали полноразмерный инфекционный клон SHC014-CoV на основе подхода, используемого для SARS-CoV (рис. 3а)2. Репликация в клетках Vero не выявила дефицита SHC014-CoV по сравнению с таковым для SARS-CoV (рис. 3б), однако SHC014-CoV был значительно (Р < 0,01) ослаблен в первичных культурах HAE как через 24, так и через 48 ч после заражения (рис.3С). In vivo заражение мышей не продемонстрировало значительной потери веса, но продемонстрировало снижение вирусной репликации в легких полноразмерной инфекции SHC014-CoV по сравнению с SARS-CoV Urbani (рис. 3d,е). Вместе взятые результаты подтверждают жизнеспособность полноразмерного SHC014-CoV, но предполагают, что требуется дальнейшая адаптация для того, чтобы его репликация была эквивалентна репликации эпидемического SARS-CoV в респираторных клетках человека и мышей.
Во время эпидемии торс-ков были быстро установлены связи между пальмовыми циветтами и штаммами ков, которые были обнаружены у людей4. Основываясь на этом выводе, общая парадигма возникновения утверждает, что эпидемический SARS-CoV возник как вирус летучих мышей, перескочил на циветт и включил изменения в рецептор-связывающий домен (RBD) для улучшения связывания с циветтой Ace2 (ref. 18). Последующее воздействие на людей на рынках живых животных позволило человеку заразиться штаммом циветты, который, в свою очередь, приспособился стать эпидемическим штаммом (рис. 4аОднако филогенетический анализ показывает, что ранние штаммы атипичной пневмонии человека, по-видимому, более тесно связаны со штаммами летучих мышей, чем со штаммамициветт18 . Таким образом, вторая парадигма утверждает, что прямая передача летучих мышей человеку инициировала возникновение SARS-CoV и что пальмовые циветты служили вторичным хозяином и резервуаром для продолжения инфекции (рис. 4Б)19 Для обеих парадигм Адаптация Спайка во вторичном хозяине рассматривается как необходимость, причем большинство мутаций, как ожидается, произойдет в пределах RBD, тем самым способствуя улучшению инфекции. Обе теории предполагают, что пулы Ковов летучих мышей ограничены и что мутации в диапазоне хозяина являются как случайными, так и редкими, что снижает вероятность будущих событий появления у людей.
Хотя наше исследование не опровергает другие пути возникновения, оно утверждает третью парадигму, в которой циркулирующие пулы ков летучих мышей поддерживают "уравновешенные" спайковые белки, способные заражать людей без мутации или адаптации (рис. 4С). Эта гипотеза иллюстрируется способностью химерного вируса, содержащего Спайк SHC014 в позвоночнике SARS-CoV, вызывать устойчивую инфекцию как в культурах дыхательных путей человека, так и у мышей без адаптации к RBD. В сочетании с наблюдением ранее выявленных патогенных ков позвоночника3,20 наши результаты показывают , что исходные материалы, необходимые для возникновения ТОРСОПОДОБНЫХ эмерджентных штаммов, в настоящее время циркулируют в резервуарах для животных. Примечательно, что хотя полноразмерный SHC014-CoV, вероятно, требует дополнительной адаптации позвоночника для опосредования заболевания человека, документированные высокочастотные события рекомбинации в семействах CoV подчеркивают возможность будущего возникновения и необходимость дальнейшей подготовки.
На сегодняшний день геномные экраны популяций животных в основном используются для выявления новых вирусов в условиях вспышек21. Данный подход расширяет эти наборы данных для изучения вопросов возникновения вирусов и терапевтической эффективности. Мы рассматриваем вирусы с шипом SHC014 как потенциальную угрозу из-за их способности реплицироваться в первичных культурах дыхательных путей человека-наилучшей доступной модели заболевания человека. Кроме того, наблюдаемый патогенез у мышей указывает на способность SHC014-содержащих вирусов вызывать заболевания в моделях млекопитающих без адаптации к RBD. Примечательно, что дифференциальный тропизм в легких по сравнению с таковым при SARS-MA15 и ослабление полноразмерного SHC014-CoV в культурах HAE по отношению к SARS-CoV Urbani предполагают, что факторы, выходящие за рамки связывания ACE2, включая Спайк-процессивность, биодоступность рецепторов или антагонизм иммунных реакций хозяина, могут способствовать возникновению эмерджентности. Однако необходимы дальнейшие испытания на нечеловеческих приматах, чтобы перевести эти находки в патогенный потенциал человека. Важно отметить, что отсутствие доступных терапевтических средств определяет критическую потребность в дальнейших исследованиях и разработке методов лечения. Благодаря этим знаниям могут быть разработаны программы эпиднадзора, диагностические реагенты и эффективные методы лечения, которые защищают от появления специфических ков группы 2b, таких как SHC014, и они могут быть применены к другим ветвям ков, которые поддерживают аналогичные гетерогенные пулы.
Помимо предложения подготовки к борьбе с будущими возникающими вирусами, этот подход должен рассматриваться в контексте санкционированной правительством США паузы в исследованиях усиления функции (GOF)22. Исходя из предыдущих моделей эмерджентности (рис. 4а,б), создание химерных вирусов типа SHC014-MA15 не должно было приводить к повышению патогенности. Хотя SHC014-MA15 ослаблен относительно своего родительского мыш-приспособленного SARS-CoV, подобные исследования изучая патогенность CoV с диким типом Urbani Спайком внутри костяк MA15 не показали никакую потерю веса в мышах и уменьшили вирусную репликацию23. Таким образом, относительно Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 показывает усиление патогенеза (Рис. 1На основании этих выводов группы научных обзоров могут счесть подобные исследования по созданию химерных вирусов на основе циркулирующих штаммов слишком рискованными, поскольку нельзя исключать повышенную патогенность в моделях млекопитающих. В сочетании с ограничениями на мышиные адаптированные штаммы и разработку моноклональных антител с использованием escape-мутантов исследования возникновения ков и терапевтической эффективности могут быть серьезно ограничены в будущем. Вместе эти данные и ограничения представляют собой перекресток исследовательских проблем GOF; потенциал подготовки и смягчения последствий будущих вспышек должен быть сопоставлен с риском возникновения более опасных патогенов. При разработке дальнейшей политики важно учитывать ценность данных, полученных в результате этих исследований, а также необходимость дальнейшего изучения этих типов химерных вирусных исследований в сопоставлении с присущими им рисками.
В целом, наш подход использовал данные метагеномики для выявления потенциальной угрозы, создаваемой циркулирующим летучим мышам SARS-подобным CoV SHC014. Из-за способности химерных вирусов SHC014 реплицироваться в культурах дыхательных путей человека, вызывать патогенез in vivo и избегать современной терапии существует необходимость как в эпиднадзоре, так и в усовершенствованной терапии против циркулирующих вирусов, подобных SARS. Наш подход также открывает возможности использования данных метагеномики для прогнозирования возникновения вирусов и применения этих знаний при подготовке к лечению будущих возникающих вирусных инфекций.
